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　(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州 310013;

　　2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健所，杭州 310013)

　　摘要：目的：探索葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對II型糖尿病大鼠糖、脂代謝的影響及其是否具有輔助降血糖功能。 方法：將60只雄性SD大鼠按體重以每組10只隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、0.5 g/kg組、1 g/kg組、2 g/kg、2 g/kg正常動物組，空白和2 g/kg正常動物組飼以維持飼料，其余飼以高脂高糖飼料。在喂養(yǎng)3周2天后，模型對照組、各個(gè)劑量組大鼠腹腔注射105 mg/kg四氧嘧啶(alloxan，ALX)，5天后各組動物禁食4H，尾靜脈采血測定各組空腹血糖和0.5H、2H糖耐量;眼內(nèi)眥取血，分離血清測定血清胰島素、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平。 結(jié)果：2 g/kg葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽可以顯著提高糖尿病大鼠0.5H糖耐量(p<0.01);各個(gè)劑量組均能顯著降低糖尿病大鼠的甘油三酯TG水平(p<0.05，p<0.01);2、0.5 g/kg劑量組能顯著降低糖尿病大鼠的血清總膽固醇TC水平(p<0.05，p<0.01);高劑量樣品對正常大鼠的空腹血糖沒有影響 結(jié)論：葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽具有輔助降血糖功能。

　　關(guān)鍵詞：葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽，SD大鼠，II型糖尿病，多肽，血糖

　　Experimental study on the effect of GeHong Tangtai Double melon compound peptide on hypoglycemia in type 2 diabetic rats

　　(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州 310013;

　　2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健所，杭州 310013)

　　Abstract: Objectine：To explore the effect of Gehong Tang Tai Shuangkua compound peptide on glucose and lipid metabolism in type 2 diabetic rats and whether it has assisting hypoglycemic function. Methods: male SD rats were randomly divided into blank control group, model control group, 0.5 g/kg group, 1 g/kg group, 2 g/kg group, and 2 g/kg normal animal group according to their body weight with 10 in each group. The blank and 2 g/kg normal animal group were fed to maintain the diet, and the rest were fed with high-fat and high-sugar diet. After 3 weeks and 2 days of feeding, rats in the model control group and each dose group were intraperitoneally injected with 105 mg/kg alloxan. After 5 days, animals in each group fasted for 4H, collecting blood from the caudal vein asting blood to measure glucose and glucose tolerance at 0.5H and 2H were recorded ;blood from the inner canthus was collected, serum levels of serum insulin, total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were isolated and measured,. Results: 2 g/kg Gehong Tangtai double melon compound peptide significantly increased glucose tolerance in diabetic rats by 0.5H (P <0.01). Triglyceride TG level of diabetic rats was significantly reduced in each dose group (P <0.05, P <0.01). 2. The serum TC level of total cholesterol(TC) in the 0.5 g/kg group of diabetic rats was significantly reduced (P <0.05, P <0.01). The high-dose samples had no effect on the fasting blood glucose of normal rats. Conclusion: The compound peptide of Gehong Tang Tai Double melon has the function of assisting hypoglycemic.

　　Key words：Gehong Tangtai double melon complex peptide, SD rats, Type 2 diabetes, polypeptide, blood glucose

　　糖尿病(Diabetes mellitus， DM)是由多種因素引起的一種以高血糖為特征的代謝紊亂綜合征，是一種伴有胰島素分泌障礙的終身性疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization ， WHO))的預(yù)測，2030年全球糖尿病人數(shù)將會達(dá)到36.6億人[2]。根據(jù)患者胰島素的相對或絕對缺乏，將糖尿病分為I型糖尿病和II型糖尿病，其中90%以上為II型糖尿病[3]。超90%的II型糖尿病患者出現(xiàn)胰島素分泌不全或胰島素抵抗，誘發(fā)心臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等器官功能障礙，出現(xiàn)一系列并發(fā)癥[4]。目前臨床治療糖尿病的藥物主要是磺酰脲類，咪唑啉類和雙胍類等化學(xué)合成藥，雖然短期療效顯著，但常伴有不同程度的副作用[5]，如心血管疾病、過敏反應(yīng)等，大大限制其臨床使用。功能性食品不以治療疾病為目的，能夠調(diào)節(jié)適宜特定人群生理功能，不受耐藥性、藥物副作用等影響[6]，在預(yù)防、輔助降血糖方面有較大發(fā)展前景。如何進(jìn)行糖尿病的防治保健，尋找安全、有效的治療糖尿病的活性物質(zhì)，特別是從天然資源中去篩選和研究活性降糖成分，已成為國內(nèi)外醫(yī)藥工作者所關(guān)注的重要課題和迫在眉睫的任務(wù)。

　　苦瓜為葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜的果實(shí),又稱癲葡萄和錦荔枝,長用蔬菜之一,味苦性寒,無毒。其根、莖、葉、花、果實(shí)和種子在世界各地均有藥用記載 [7-9]。苦瓜中的降糖多肽 -P降血糖作用顯著，與優(yōu)降糖相比其降糖作用緩慢而持久,有類似胰島素的作用,被譽(yù)為"植物胰島素"[10]，可以顯著降低四氧嘧啶模型鼠的血糖[11]。人們也常用苦瓜的復(fù)方制劑來治療糖尿病。徐光明[12]用苦瓜素溶液、黃芪水提濃縮液、白術(shù)水提濃縮液混合，制成天然苦瓜素降糖藥，治療 I型糖尿病和II型糖尿病。

　　葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽由深圳松茂堂糖尿病研究院研發(fā)，從苦瓜等天然瓜類植物中提取降糖多肽復(fù)合物。在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用四氧嘧啶(alloxan，ALX)結(jié)合高熱能飼料誘導(dǎo)大鼠糖、脂代謝異常模型，通過葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽作用于糖尿病大鼠模型，研究葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對糖尿病大鼠的降血糖和調(diào)節(jié)脂代謝作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與儀器

　　葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽 深圳松茂堂糖尿病研究院有限公司提供;實(shí)驗(yàn)動物：清潔級Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，體重體重200±20 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物生產(chǎn)許可證號，動物合格許可證號;高糖高脂飼料( 粉狀) 配方：15%蔗糖、10%豬油、15%蛋黃粉、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，5%酪蛋白、0.6%磷酸氫鈣、0.4%碳酸鈣;胰島素Elisa檢測試劑盒、TC、TG測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;四氧嘧啶 美國sigma公司;血糖試紙 強(qiáng)生穩(wěn)豪型;血糖儀 強(qiáng)生。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1粉狀高脂高糖飼料制備

　　按比例稱重10%蛋黃粉、15%蔗糖、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，5%酪蛋白、0.6%磷酸氫鈣、0.4%碳酸鈣，混合均勻后加入融化好的豬油(10%的比例)，邊加邊攪拌，直至完全混合，得到高脂高糖粉狀飼料。除了粗脂肪外，模型飼料的水分、粗蛋白、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、鈣：磷等均達(dá)到維持飼料的國家標(biāo)準(zhǔn)。

　　1.2.2 實(shí)驗(yàn)條件

　　SPF級動物房，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，明暗交替時(shí)間12h/12h。

　　1.2.3 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間

　　葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽輔助降血糖功能動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)劑量組、一個(gè)正常動物組、空白對照組和模型對照組，共計(jì)6組。三個(gè)劑量組分別為2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg，分別為人體推薦量的20、10、5倍。受試樣品給予時(shí)間為4周。

　　1.2.4 實(shí)驗(yàn)流程

　　60只實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠于屏障系統(tǒng)下喂飼維持飼料適應(yīng)環(huán)境5～7天。適應(yīng)期結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)動物按體重隨機(jī)分組，10只/組，分為6組，分別為空白對照組、模型對照組、0.5 g/kg組、1 g/kg組、2 g/kg、2 g/kg正常動物組。空白對照組給予基礎(chǔ)飼料，模型對照組、0.5 g/kg組、1 g/kg組、2 g/kg給予高熱能飼料造模。實(shí)驗(yàn)動物每周稱量體重1次。實(shí)驗(yàn)實(shí)施四氧嘧啶誘導(dǎo)的胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型，在喂養(yǎng)3周2天后，模型對照組、各個(gè)劑量組大鼠腹腔注射105 mg/kg四氧嘧啶，5天后各組動物禁食4H，眼內(nèi)眥取血，分離血清測定血清胰島素、TC、TG水平，并檢測各組實(shí)驗(yàn)動物的空腹血糖值。之后空白組、模型組給予自來水，正常動物組、各個(gè)劑量組給予相應(yīng)劑量和體積樣品，20min后灌胃給予2.5g/kg葡萄糖粉，分別檢測給予葡萄糖粉0.5H、2H后大鼠血糖計(jì)算糖耐量。

　　2 g/kg正常動物組給予維持飼料，葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽2g/kg經(jīng)口給予4周后，按上述方法測定空腹血糖、糖耐量等多項(xiàng)指標(biāo)，探究樣品對正常大鼠血糖、血脂的影響。

　　1.2.5動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团卸��?biāo)準(zhǔn)

　　判定模型糖代謝異常的標(biāo)準(zhǔn)：若模型組0.5小時(shí)血糖值≥10mmol/L，或模型對照組0.5小時(shí)、2小時(shí)任一時(shí)間點(diǎn)血糖升高或血糖曲線下面積升高，與空白對照組比較，差異有顯著性，判定模型糖代謝紊亂成立，在此基礎(chǔ)上，觀察模型對照組與受試樣品組空腹血糖、給葡萄糖后(0.5、2小時(shí))血糖及0、0.5、2小時(shí)血糖曲線下面積的變化。

　　血糖曲線下面積=+

　　判定模型脂代謝異常的標(biāo)準(zhǔn)：若模型對照組血清膽固醇或甘油三酯明顯升高，與空白對照組比較，差異有顯著性，判定模型脂代謝紊亂成立，在此基礎(chǔ)上，觀察模型對照組與受試樣品組血脂變化。

　　判定樣品是否具有輔助降血糖功能的標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖和糖耐量二項(xiàng)指標(biāo)中一項(xiàng)指標(biāo)陽性，血脂(總膽固醇、甘油三酯)無明顯升高，且對正常動物空腹血糖無影響，即可判定該受試樣品輔助降血糖功能動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

　　1.2.6數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

　　2 結(jié)果分析

　　2.1給予葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對各組大鼠體重的影響

　　實(shí)驗(yàn)實(shí)施4周過程中，葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對各組大鼠體重的影響見表1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各組實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)開始第一周體重沒有明顯差異;高熱能飼料給予2周后，葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽2g/kg、0.5g/kg劑量組實(shí)驗(yàn)動物的體重有所下降，并與空白組、模型組大鼠的體重形成顯著性差異(p<0.05，p<0.01);而2 g/kg葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽正常動物組、1 g/kg劑量組沒有出現(xiàn)減重趨勢;實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第三周，樣品2g/kg、0.5g/kg的體重開始增加，雖然0.5g/kg劑量組的體重與空白組比較，仍有顯著差異(p<0.05)，但是與模型組相比較，各劑量組的體重值均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)至第四周，各組實(shí)驗(yàn)動物體重仍然緩慢增加，樣品2g/kg、0.5g/kg組體重增加的幅度相對較弱，但與空白組、模型組相比較均沒有顯著性差異。整體來講，葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽樣品對于動物體重的影響有限。

　　2.2高劑量葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對正常動物血糖、血脂的影響

　　高劑量正常動物組給予樣品葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽2g/kg，4周后測定記錄實(shí)驗(yàn)動物的空腹血糖、糖耐量、血糖曲線下面積、TG及TC和胰島素水平。

　　2.2.1葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對正常動物血糖的影響

　　從表2可以看出，正常動物組(給予高劑量2 g/kg，并給予維持飼料)灌喂葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽4周，空腹血糖值與空白對照組相比，無顯著差異;糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽2 g/kg組實(shí)驗(yàn)動物的糖耐量能力不受樣品影響。因此葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽高劑量不影響正常動物的血糖及糖代謝能力。

　　2.2.2 葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對正常動物血脂的影響

　　從表3可以看出，正常動物組給予高劑量(2g/kg)葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽4周，TC與空白對照組相比，無顯著差異;TG與空白對照組相比較，顯著降低且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，因此葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽高劑量不升高正常動物的血脂指標(biāo)。

　　2.3 各劑量組葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對糖尿病大鼠血糖、血脂的影響

　　2.3.1空腹血糖

　　表2中0H血糖即為空腹血糖。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，空白組與模型對照組相比較，空腹血糖值有差異，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異。葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽各劑量給予4周后，與模型對照組相比較，各個(gè)劑量組的空腹血糖均有所下降，但各個(gè)組的空腹血糖與模型對照組都沒有形成統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，空腹血糖指標(biāo)陰性。

　　2.3.2糖耐量、血糖曲線下面積

　　表2中0.5H、2H血糖值即為糖耐量值。從表2可以看出，模型對照組0.5H糖耐量為14.43±2.45mmol/L，與空白對照組10.36±1.04mmol/L相比較，結(jié)果具有顯著性差異(p<0.01)。根據(jù)模型糖代謝異常的標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)糖代謝紊亂模型成立。

　　從表2可以看出，實(shí)驗(yàn)動物灌胃給予2.5g/kg葡萄糖后，各組的血糖值均在0.5H達(dá)到峰值。此時(shí)與模型對照組相比較，葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽高劑量組2g/kg的糖耐量顯著降低(p<0.01)，1g/kg、0.5g/kg的糖耐量與模型對照組相比較，沒有顯著差異。在灌服葡萄糖溶液0.5h內(nèi)，2 g/kg劑量組的血糖值降幅最大，糖耐量能力最強(qiáng)。至2H時(shí)空白組的血糖值略低于模型對照組，其他各劑量組的血糖值與模型組相似、樣品各劑量組實(shí)驗(yàn)動物糖耐量能力均有所下降，其中高劑量組與模型對照組相比較具有顯著差異(p<0.01)。各劑量組血糖曲線下面積與模型對照組均無顯著性變化(p>0.05)。

　　葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽給予4周后，灌服葡萄糖0.5H后，與模型對照組比較，2 g/kg劑量組的糖耐量顯著下降(p<0.01)，因此樣品糖耐量指標(biāo)結(jié)果陽性。灌服葡萄糖2H后，各個(gè)劑量組的糖耐量與模型對照組相當(dāng)，但樣品2g/kg劑量組血糖值得下降略微緩慢。

　　4. 3 給予葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽對各組大鼠血清胰島素、TC、TG的影響

　　從表3可以看出，給予高熱能飼料4周后，各組大鼠的血清胰島素沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。給予高熱能飼料4周后，空白對照組與模型對照組的TG、TC指標(biāo)形成顯著性差異(p<0.01)，本實(shí)驗(yàn)脂代謝紊亂模型成立;當(dāng)實(shí)驗(yàn)動物同步給予葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣品各個(gè)劑量組均能顯著降低糖尿病大鼠的甘油三酯TG水平(p<0.05，p<0.01);同時(shí)2、0.5 g/kg劑量組還可以降低高血糖大鼠的血清總膽固醇TC水平(p<0.05，p<0.01)。

　　葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽不僅沒有顯著升高糖尿病大鼠的TG、TC含量，而且部分劑量組能夠顯著降低TG、TC含量。因此在糖代謝紊亂的情況下對脂代謝沒有產(chǎn)生影響，即葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽不影響糖脂代謝異常的實(shí)驗(yàn)動物的脂代謝能力。

　　綜上，在實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的時(shí)間和劑量范圍內(nèi), 2 g/kg葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽給予四周可以顯著提高糖尿病大鼠0.5H糖耐量(p<0.01)，0.5H糖耐量陽性;各個(gè)劑量組均能顯著降低糖尿病大鼠的甘油三酯TG水平(p<0.05，p<0.01);2、0.5 g/kg劑量組能顯著降低糖尿病大鼠的血清總膽固醇TC水平(p<0.05，p<0.01)，TC、TG無明顯升高且降低;高劑量樣品對正常大鼠的血糖沒有影響，可以判定葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽具有輔助降血糖功能，可以作為功能性食品輔助糖尿病患者更好控制血糖，提高生活質(zhì)量。

　　3、結(jié)果與討論

　　正常情況下，胰島素抑制脂肪的分解 ,促進(jìn)脂肪的合成。當(dāng)胰島素敏感性下降時(shí), 胰島素抑制脂肪分解、促進(jìn)脂肪合成的生物活性降低。動物體內(nèi)脂肪分解增加 ,游離脂肪酸濃度升高,使膽固醇、甘油三酯合成增加 ,高密度脂蛋白減少，誘導(dǎo)高血糖和血脂紊亂，進(jìn)一步促進(jìn)胰島素抵抗并破壞胰島β細(xì)胞[13]。II型糖尿病( T2DM) 的發(fā)病機(jī)制主要為胰島素抵抗和胰島素分泌相對不足，由于糖的生成增加而分解減慢導(dǎo)致高血糖及糖尿,同時(shí)乙酰CoA通過三羧酸循環(huán)分解減少合并脂代謝紊亂,在NADH和NADPH還原下轉(zhuǎn)化成酮體,使糖尿病人并發(fā)酮血癥及酮尿癥[14]。四氧嘧啶能高度選擇性破壞胰島β細(xì)胞而對其它組織器官無明顯毒副作用，被廣泛用于糖尿病動物模型建立。有研究顯示雄性大鼠的成模率明顯高于雌性大鼠[15]。故本實(shí)驗(yàn)以雄性 SD 大鼠為研究對象，首先以高糖高脂飼料喂養(yǎng)3周以上，誘導(dǎo)外周組織的胰島素抵抗，然后用小劑量四氧嘧啶特異性破壞部分胰島 β 細(xì)胞，誘導(dǎo)胰島素分泌減少，兩者結(jié)合能夠誘導(dǎo)出生理、病理改變都接近于人類 2 型糖尿病的動物模型，進(jìn)而模擬人類 T2DM 發(fā)病過程[16]。

　　在實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的時(shí)間和劑量范圍內(nèi)，葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽給予4周可以降低II型糖尿病大鼠的血糖(p>0.05);2 g/kg劑量組可以顯著提高糖尿病大鼠0.5H糖耐量(p<0.01);同時(shí)不影響血脂代謝，TC、TG無升高;并且葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽高劑量對正常大鼠的空腹血糖沒有影響，可以判定葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽具有較好的輔助降血糖功能。

　　葛洪唐泰雙瓜復(fù)合肽的降糖作用可能與其從苦瓜等天然植物中提取的多肽復(fù)合物有關(guān)。多肽是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，參與調(diào)控人體激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝等多個(gè)領(lǐng)域。已有研究證明苦瓜多肽 -P可提高胰島素敏感指數(shù), 提高肝臟、肌肉對胰島素的敏感程度，增強(qiáng)肝糖原和肌糖原的含量，推測其降血糖機(jī)理可能為改善胰島素抵抗[11]。盛清凱等[17]證實(shí)苦瓜多肽-P 可改善 2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，打斷糖尿病大鼠高血糖、高胰島素、胰島素分泌不全間的惡性循環(huán)，使血糖和胰島素恢復(fù)至正常水平。苦瓜多肽-P 改善胰島素抵抗的機(jī)理有待進(jìn)一步研究發(fā)掘，可能與不同信號通路的激活與抑制有關(guān)。

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